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Institut für Virologie, Infektiologie und Epidemiologie e.V. Vorsitzende: Prof. Dr. med. Gisela Enders

LABOR ENDERS Prof. Dr. med. G. Enders & Partner Rosenbergstraße 85 — 70193 Stuttgart — Telefon 0711/6357-0 — Telefax 0711/6357-202 Info-Nr.:59, Februar 2003, August 2010, Update: Dezember 2011

ANA-Stufendiagnostik

Die Stufendiagnostik im Rahmen der Abklärung einer Autoimmunerkrankung beginnt mit der Bestimmung von Autoantikörpern (AAK) gegen Zellkerne, auch ANA (antinukleäre Antikörper) genannt. Das ANA-Screening wird mittels Immunfluoreszenztest (IFT) auf Objektträgern mit fixierten Zellen (HEp-2-Zellen und Affenleberzellen) durchgeführt. Lokalisation und Muster der Fluoreszenz deuten auf die Spezifität der vorliegenden Autoantikörper hin. Das Immunfluoreszenzmuster ist meist typisch, jedoch nicht spezifisch, da ähnliche Muster bei zahlreichen AAK mit oft unbekannten Antigenen vorkommen. Manchmal überlappen sich mehrere Fluoreszenzmuster (z.B. wird ein gesprenkeltes Muster häufig von einem homogenen Muster überdeckt). Bei positivem Screeningtest sollten weitere Untersuchungen zur genauen Bestimmung der AAKSpezifität folgen. Nur die weitere Differenzierung ermöglicht die Einordnung des Befundes im Rahmen der klinischen Fragestellung. Wichtigste Fluoreszenzmuster und die mit ihnen assoziierten Autoantikörper sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt.

 Copyright Prof. G. Enders

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Tabelle 1: AAK gegen Kernantigene Beschreibung des Fluoreszenzmusters

Verdacht auf Antikörper gegen:

Homogen, positive Färbung der Chromosomen im Mitosestadium

dsDNS, Histone und Nukleosomen

Gesprenkelt, negative Färbung der Chromosomen im Mitosestadium

SS-A (Ro60 und Ro52), SS-B, U1-RNP, Sm; Ku und Mi-2

Nukleolär, negative Färbung der Chromosomen im Mitosestadium

Fibrillarin, Pm-Scl, NOR-90, RNAP und To/Th

Nukleolär + homogen, positive Färbung der Chromosomen im Mitosestadium

Scl-70

Sprenkelung in den Interphasekernen und im kondensierten ChromosomenMaterial der mitotischen Zellen

Zentromere

Nukleäre Tupfen (dots)

Sp100

Kernmembran

Lamin, gp210

Pleomorph

PCNA

Bild-Beispiel

Die Immunfluoreszenzbilder wurden uns freundlicherweise von der Fa. Euroimmun zur Verfügung gestellt

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Bei gesprenkeltem und wegen der Gefahr der Überdeckung auch bei homogenem Fluoreszenzmuster der ANA müssen weitere Teste zur Bestimmung von Antikörpern gegen ENA (extrahierbare nukleäre Antigene) durchgeführt werden. Bei der Bestimmung von ENA-AAK werden die Seren im ersten Analyseschritt mit einem ScreeningEIA untersucht. Diese EIA-Riegel sind mit einem Antigenpool aus folgenden Antigenen beschichtet: SS-A (ro60 und Ro52), SS-B, U1-RNP, RNP70, Sm, Scl-70, Jo1und Centromere B. Bei positivem Ergebnis erfolgt die Differenzierung der AAK-Spezifität mittels Einzelantigen-EIA. Bei positiver Färbung der Chromosomen im Mitosestadium müssen zusätzlich zu den Antikörpern gegen ENA noch Antikörper gegen dsDNS, Histone und Nukleosomen mittels ELISA bestimmt werden. Alle nukleolären AAK gelten als Marker für die Sklerodermie und deren Overlap-Phänomene und bedürfen deshalb nicht zwingend einer weiteren Differenzierung. Der Immunfluoreszenztest auf Objektträgern mit fixierten HEp-2-Zellen ermöglicht neben der Bestimmung von AAK gegen Kernantigene auch den Nachweis von AAK gegen Zytoplasmabestandteile. Tabelle 2: AAK gegen Zytoplasmabestandteile Beschreibung des Fluoreszenzmusters

Verdacht auf Antikörper gegen:

Feingesprenkelt

Ribosomen, Jo-1 und andere Synthetasen

Grobgesprenkelt

Mitochondrien

Filamentös

Aktin, Myosin und andere Mikrofilamenten

Bild-Beispiel

Die Immunfluoreszenzbilder wurden uns freundlicherweise von der Fa. Euroimmun zur Verfügung gestellt

Bei feiner granulärer Fluoreszenz des Zytoplasmas müssen ELISA-Teste zum Nachweis von AAK gegen Ribosomen und Jo-1 durchgeführt werden. Grobgesprenkelte Muster deuten auf antimitochondriale AAK (AMA) hin. Eine filamentöse Fluoreszenz ist für AAK gegen glatte Muskulatur (SMA) typisch. Diese AAKSpezifitäten müssen zusätzlich durch IFTs auf Organschnitten bestätigt werden.

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Ab welchem ANA-Titer ist eine weitere Stufendiagnostik sinnvoll? Tabelle 3: Prozentanteil der positiven Nachweise für dsDNS-AAK und ENA-AAK, bezogen auf die Anzahl der Gesamtuntersuchungen (Phadia EliA, Daten Labor Prof. G. Enders). ANA-Titer

<1:80 1:80–1:160 >=1:320

dsDNSENADie Wahrscheinlichkeit eines positiven dsDNS- oder ENApositive Nachweises hängt von der Höhe des ANA-Titers ab (Tabelle 3). positive Seren (%) Seren (%) Eine weitere Stufendiagnostik nach einem positiven ANAScreening sollte daher in der Regel ab einem ANA-Titer von 1:320 durchgeführt werden. Bei anhaltendem Verdacht auf eine Autoimmunerkrankung kann die Bestimmung der dsDNS- und 0,6 2,7 ENA-AAK schon ab einem Titer von 1:80 versucht werden. Bei schwangeren Frauen sollte der ENA-ELISA auch bei negativem 3,0 4,8 ANA-Test durchgeführt werden, um das Vorliegen von SS-A-AAK auszuschließen. 26,1 37,8

Wie sind ANA-Befunde zu interpretieren? Der Nachweis von dsDNS-AAK und ENA-AAK ist hoch spezifisch für eine Autoimmunerkrankung [Conrad 2006, Kavanaugh 2000]. Mit bestimmten Krankheitsbildern assoziierte Autoantikörperprofile sind in der Tabelle "Autoimmundiagnostik nach Leitsymptomen und Krankeitsbildern" und im Laborprogramm zu finden. Leider können nicht alle positiven Immunfluoreszenz-Befunde mit hohem ANA-Titer mittels ELISA weiter differenziert werden, da zahlreiche Antigene noch nicht bekannt sind. Unsere eigene, mehrjährige Erfahrung hat gezeigt, dass in Seren mit ANA-Titer von >1:320 in ca. 20–30 % ds-DNSAAK und in ca. 30–40 % ENA-AAK nachgewiesen werden. AAK in hohen Titern, die in dsDNS- und ENA-ELISA negativ sind, weisen auf eine Erkrankung hin, bei der es sich jedoch nicht zwingend um eine Kollagenose handeln muss. Diese AAK werden auch im Rahmen anderer Erkrankungen und bei klinisch Gesunden gefunden [Vaile 2000, ]. Dabei muss jedoch berücksichtigt werden, dass hohe ANA-Titer schon vor Auftreten einer SLE-typischen Symptomatik nachgewiesen werden können [Arbuckle 2003]. Niedrige ANA-Titer (1:80 bis 1:320) kommen häufig auch bei Gesunden vor (bis zu 30 %) [Craig 1999, Tan 1997]. Andererseits schließt ein niedriger AAK-Titer bzw. ein negativer Befund eine Autoimmunerkrankung nicht gänzlich aus (1–5 % der SLE Patienten sind ANA-negativ). Die erhobenen Laborergebnisse sollen deshalb immer nur im Zusammenhang mit dem klinischen Bild beurteilt werden. Literatur: Arbuckle MR et al. Development of autoantibodies before the clinical onset of systemic lupus erythematosus. N Engl J Med. 2003 Oct 16;349(16):1526-33. Conrad K, Schößler W, Hiepe F. Autoantikörper bei systemischen Autoimmunerkrankungen. Ein diagnostischer Leitfaden. Pabst Science Publischers, D-49525 Lengerich 2006 Craig WY et al. The distribution of antinuclear anti-body titers in "normal" children and adults. J Rheumatol. 1999 Apr;26(4):914-9. Kavanaugh A, et al Guidelines for clinical use of the antinuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. American College of Pathologists. Arch Pathol Lab Med. 2000 Jan;124(1):71-81 Sack U et al. die deutsche EASI-Gruppe (European Autoimmunity Standardization Initiative). Autoantibody detection by indirect immunofluorescence on HEp-2 cells Dtsch Med Wochenschr. 2009 Jun;134(24):1278-82 Tan EM et al. Range of antinuclear antibodies in "healthy" individuals. Arthritis Rheum. 1997 Sep;40(9):1601-11 Vaile JH et al. Is high titre ANA specific for connective tissue disease? Clin Exp Rheumatol. 2000 Jul-Aug;18(4):433-8 Verstegen G et al. Detection and identification of antinuclear antibodies (ANA) in a large community hospital. Acta Clin Belg. 2009 Jul-Aug;64(4):317-23.

Dr. med. Elena Ladwig

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Dr. med. F. Tewald

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Prof. Dr. med. Gisela Enders